تشخیص، فیلوژنی مولکولی، میزبان ها، پراکنش دنبل ها در ایران و ایجاد میکوریز در شرایط گلخانه

نمونه برداری از تمام مناطق دنبل خیز استان فارس شامل: داراب، فسا، شیراز، سروستان، لارستان، جهرم، استهبان، لامرد، سپیدان،خرامه، سیخ دارنگون، نورآباد و کازرون و همچنین استان های سیستان بلوچستان، کرمان، هرمزگان، یاسوج، لرستان، کرمانشاه، کردستان و تبریز از ماه های بهمن تا اردیبهشت 1385 تا 1390 در چندین نوبت صورت گرفت. نمونه ها از مراتعی برداشت شدند که گیاهان غالب این مراتع از خانواده ی cistaceae, cypraceae, brassicaceae, poaceae, zygophyllaceae و cypraceae بودند. بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و مولکولی پنج گونه شامل terfezia claveryi, tirmania nivea, tirmania pinoyi, picoa lefebvrei و picoa juniperi تشخیص داده شدند که چهار گونه ی t. claveryi، t. nivea، p. lefebvrei و p. juniperi برای فلور قارچی ایران جدید می باشند. مطالعات مزرعه ای، آزمایشگاهی و آناتومیکی نشان داد که helianthemum ledifolium var. ledifolium, h. salicifolium var. salicifolium, h. lippii و carex stenophylla با پنج گونه ی دنبل، رابطه ی میکوریزی از نوع خارجی دارند. در بررسی جوانه زنی آسکوسپورها، بهترین درجه حرارت برای جوانه زنی آسکوسپورها در t. claveryi دمای ?c 15 و مدت زمان لازم برای جوانه زنی بین 35 تا 40 روز بود.. جوانه زنی آسکوسپورها در دماهای 5، 10، 30 و ?c 35 صورت نگرفت و بین دماهای 20 و ?c 25 نیز اختلاف معنی داری وجود نداشت. بهترین محیط کشت برای توسعه میسلیوم بعد از جوانه زنی fontana agar بود. در بررسی میکوفلور دنبل های ایران، 32 گونه قارچی متعلق به 21 جنس روی محیط کشت glucose-czapeks agar و %20 nacl-czapeks agar جدا سازی شد که گونه های penicillium و aspergillus فراوانترین گونه های جداسازی شده از خاک اطراف دنبل ها بودند. قارچ های جداسازی شده روی محیط کشت %20 nacl-czapeks agar طیف کمتری از جنس ها و گونه های قارچی نشان دادند که شامل 4 جنس و 10 گونه بود. نتایج آنالیز خاک های جمع آوری شده از مناطق مختلف دارای دنبل نشان داد که در ساختار و میزان آهک خاک اختلاف کمی وجود دارد و غالب خاک های جمع آوری شده بازی، غیر شور، با میزان مواد آلی کم، شنی و میزان آهک بالا داشتند. نتایج آنالیز تطبیق متعارفی نشان داد همبستگی معنی داری بین پارامترهای محیطی و ارتفاع از سطح دریا با پراکنش گونه ها وجود دارد، به طوری که گونه های tirmania در خاک هایی با سیلت و آهک بالا یافت می شوند و ارتفاع از سطح دریا در این مناطق کم هست. در صورتی که گونه های picoa در خاک های شنی یافت شدند و ارتفاع از سطح دریا در این مناطق غالبا بالاست. به منظور تشخیص مولکولی میزبان های گیاهیt. claveryi ، ریشه گونه های مختلف helianthemum و دیگر گونه های گیاهی از خانواده های مختلف گیاهی، از مراتع مختلف استان فارس و دیگر استان های ایران جمع آوری شدند. زیر واحد کوچک ریبوزومی دی ان ای ژنومی استخراج شده از ریشه گیاهان، به روش واکنش زنجیره ای پلی مراز تو در تو با استفاده از آغازگرهای عمومی و اختصاصی طراحی شده بر اساس توالی های جدا کننده ی نسخه برداری شده ی داخلی 1، 2 و ژن 8/5 اس دی ان ای ریبوزومی t. claveryi تکثیر شدند. کارایی واکنش زنجیره ای پلی مراز تو در تو نشان داد که این روش قادر به تکثیر مجدد محصول واکنش زنجیره ای پلی مراز و ردیابی دی ان ای ژنومی تا دو فمتو گرم می باشد. چند شکلی طولی قطعات برشی با استفاده از دو آنزیم برشی hinf i و alu i صورت گرفت. نتایج توالی نوکلئوتیدی نشان داد که توالی ها از گیاهان آلوده گل آفتاب همولوژی بسیار بالا با توالی t. claveryi دارند. با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز تو در تو ده نمونه از هر گونه گیاهی بررسی شد و در نهایت دو گونه helianthemum lippii و h. salicifolium به عنوان میزبان های این گونه قارچی در گیاهان مایه زنی شده در شرایط گلخانه و مراتع مختلف استان فارس و دیگر استان ها تشخیص داده شدند. برای تشخیص گونه های picoa دو آغاز گر اختصاصی برای (fju/rju) p. juniperi و دو آغازگر اختصاصی برای p. lefebvrei (fpl/rpl) طراحی شد. به منظور ایجاد بیشترین اختصاصیت و کارایی، دمای هم جوشی و زمان گسترش برای هر یک از مجموعه ها بهینه سازی گردید. کلیه ی آغازگرها نسبت به گونه ی خودی شان اختصاصی بودند و هیچ کدام، دی ان ای خالص شده از سایر دنیل ها و برخی از آسکومیست ها را تکثیر نکردند. حساسیت آغاز گر اختصاصی p. juniperi، 200 فمتو گرم و حساسیت آغازگر اختصاصی p. lefebvrei، 10 فمتو گرم بود. آغازگر اختصاصی fju/rju، با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز تو در تو و به کمک آغازگرهای عمومی its1 و its4 قادر به ردیابی p. juniperi در ریشه گیاه میزبان (helianthemum ledifolium) بود. آغازگرهای طراحی شده برای درک اکولوژی دنبل های بیابانی و مدیریت کاشت مفید هستند. تنوع بین و فراگونه ای در میان 30 جدایه از دنبل های ایران، به وسیله ی آنالیز چند شکلی طولی قطعات برشی توالی های جداکننده ی نسخه برداری شده ی داخلی دی ان ای ریبوزومی بررسی شد. بعد از هضم آنزیمی، قطعات برشی حاصله برای تعیین فاصله زنتیکی بین جدایه ها امتیاز دهی شدند (صفر عدم باند و یک حضور باند). این فواصل برای کلاستر بندی جدایه ها به روش upgma با ضریب تشابه جاکارد با استفاده از نرم افزار mvsp مورد ارزیابی قرار گرفتند. آنزیم های برشی alu i, msp i, hinf i و mse i بیشترین چند شکلی را در قطعات تکثیری ایجاد کردند. الگوی بدست آمده برای پنج گونه اختصاصی بود.